本文是学习GB-T 32945-2016 牛结核病诊断 体外检测γ干扰素法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了牛结核病诊断 体外检测γ干扰素法的缩略语、原理、试剂、采样和操作步骤。
本标准适用于牛结核病的早期诊断、检疫、监测与流行病学调查。
下列缩略语适用于本文件。
A-PPD: 禽结核菌素(avian purified protein derivative)
B-PPD: 牛结核菌素(bovine purified protein derivative)
ELISA: 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay)
HRP: 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)
IFN-Y:Y-干扰素(interferon gamma)
IgG:免疫球蛋白G(immunoglobullin G)
PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution)
OD: 光密度值(optical density)
感染牛分枝杆菌的结核阳性牛，其外周血淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆。当体外
遇到牛分枝杆菌特异性抗原(牛结核菌素)刺激时，淋巴细胞将被激活，发生再次细胞免疫反应，大量释
放 IFN-Y。 通过夹心ELISA 检测 IFN-
γ浓度水平，即可诊断牛分枝杆菌感染。禽分枝杆菌属于非结核
分枝杆菌，以禽结核菌素刺激淋巴细胞作为对照，可有效排除环境分枝杆菌感染导致的非特异性反应。
4.1.9 一次性无菌离心管(2 mL)。
4.1.10 一次性肝素钠抗凝采血管。
4.1.11 一次性注射器(5 mL)。
GB/T 32945—2016
4.1.12 微孔滤膜(0.22 μm)。
B-PPD 工作液、A-PPD 工作液、PBS、 牛 IFN- γ单克隆抗体、兔抗牛 IFN- γ
多克隆抗体、HRP 标记
的羊抗兔IgG 酶标二抗、底物液、包被液、封闭液、洗涤液和终止液。
试剂配制方法见附录 A。
无菌采集待检牛血液4 mL～5mL,
立即转移至含肝素钠抗凝剂的一次性无菌采血管中(肝素钠终 浓度为15 U/mL),
轻轻缓慢颠倒3次～5次使血液与肝素钠混匀，18℃~25℃保存，30 h 内送达实验
室进行刺激培养。
样品收集过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护，具体注意事项见附录B。
将抗凝血加入2 mL 无菌离心管中，每管1 mL, 每份血液样品设3个管，分别标记为
B-PPD、A- PPD 和 PBS 管。向标记管中相应加入100 μL 的 B-PPD、A-PPD 和
PBS, 盖严，轻摇使血液与加入的刺 激物充分混合，于37℃培养箱中静置培养16
h～20h。 收集细胞培养上清，立即用于IFN- γ 检测，或置
-20℃保存待检。
样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护，具体注意事项见附录
B。
4.3.3 夹心 ELISA 测定 IFN- γ 浓度
4.3.3.1 试剂配制
见附录 A。
4.3.3.2 包被
用包被液将牛 IFN- γ
单克隆抗体稀释至工作浓度，加入酶标板孔中，每孔100μL (每孔含抗体约
35 ng),在2℃~8℃放置12 h。
4.3.3.3 洗涤
弃去孔内包被液，用洗涤液洗板3次。每次300μL/ 孔，每次静置1 min
后弃去洗涤液，洗涤完毕后
在吸水纸上拍干。
4.3.3.4 封 闭
每孔加入200 μL 封闭液，置37℃孵育1 h。 重复4.3.3.3。
4.3.3.5 加入待检样品
将4.3.2步骤收集的待检培养上清分别加入封闭好的酶标板孔中，100μL/孔，其中
B-PPD 刺激上 清标记为 B 孔，A-PPD 刺激上清标记为 A 孔，PBS
刺激上清标记为 P 孔；同时设置1个空白对照孔，孔
中直接加入100μLPBS。37℃ 作用45 min,洗涤3次，方法见4.3.3.3。
4.3.3.6 加入兔抗牛 IFN- γ
多克隆抗体
用洗涤液将兔抗牛 IFN- γ多克隆抗体稀释至标定的浓度，100μL/孔，37℃作用30
min,洗涤3次，
GB/T 32945—2016
4.3.3.3 。
4.3.3.7 加入 HRP 标记的羊抗兔
IgG 酶标二抗
用洗涤液将 HRP 标记的羊抗兔IgG
酶标二抗稀释至标定的浓度，100μL/孔，37℃作用30 min,
4.3.3.3 。
4.3.3.8 显色和终止反应
每孔先加入底物液 A50μL, 再加入底物液B50μL, 室温避光显色10 min。
每孔加入50 μL 终止
液。5 min 内在酶标仪上测定630 nm 波长处的吸光度(OD
值),测定前须用空白对照孔调零。
4.3.3.9 结果判定
B-PPD 刺激上清孔的 OD₃m 值记作 ODppp,A-PPD 刺激上清孔的 OD₃nm 值记作
ODxppp,PBS
刺激上清孔的OD30m 值记作ODs。 计算 OD;pp、ODpmp 及
ODmus之间的差值，当ODpp-ODmis≥0.2
且ODappp-ODxppp≥0.2 判为阳性；其他情形均判为阴性。
GB/T 32945—2016
(规范性附录)
试 剂 配 制
A.1 血细胞刺激物
A.1.1 B-PPD 工作液
使用前将20000 IU 的牛结核菌素与PBS 按1:19混合，备用。
A.1.2 A-PPD 工作液
使用前将25000 IU 的禽结核菌素用PBS 按1:11.5混合，备用。
A.1.3 PBS(0.1 mol/L,pH7.4)
将下列试剂按次序加入1000 mL 规格的容器中，加800 mL 蒸馏水充分溶解，用1
mol/L 盐酸
(HCl) 或 1 mol/L 氢氧化钠(NaOH) 调节至 pH7.4, 定容至1000 mL。
氯化钠 (NaCl) 8.0 g
氯化钾 (KCI) 0.2 g
磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄ · 12H₂O) 0.2 g
磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 2.9 g
吐温-20 (Tween-20) 0.5 mL
加蒸馏水至 1000 mL
A.2 洗涤液
含0.05%吐温-20(Tween-20) 的 PBS(pH 7.4)。
A.3 包被液
包被液为碳酸盐缓冲液(0.025 mol/L,pH 9.6)。 将下列试剂按次序加入1000 mL
规格的容器中， 加800 mL 蒸馏水充分溶解，用1 mol/L 盐酸(HCl) 或 1 mol/L
氢氧化钠(NaOH) 调节至 pH 9.6,定容
至1000 mL。
碳酸钠 (Na₂CO₃)
碳酸氢钠 (NaHCO₃)
加蒸馏水至
1000
g
g
mL
A.4 封闭液(5%脱脂奶)
洗涤液
脱脂奶粉
GB/T 32945—2016
A.5 底物 A
将下列试剂按次序加入1000 mL 规格的容器中，加800 mL 蒸馏水充分溶解，用1
mol/L 盐酸
(HCI) 调节 pH 至5.0～5.4,定容至1000 mL。
磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄ · 12H₂O)
柠檬酸 (C₆H₈O₇)
过氧化氢脲 (H₂O₂)
加蒸馏水至
1000
g
g
g
mL
A.6 底物 B
四甲基联苯二胺
无水乙醇 (C₂H₅OH)
加蒸馏水至
A.7 终止液
氢氟酸 (HF)
加蒸馏水至
GB/T 32945—2016
(资料性附录)
采样与样品处理注意事项
B.1 防止样品和环境污染措施
B.1.1 采血及血样处理过程，应进行无菌操作，防止样品污染。
B.1.2 存放血样的容器应洁净、无菌。
B.1.3
所有与样本接触的待用器材如带滤芯枪头、普通枪头、离心管等器材均应洁净无菌。
B.1.4 血样处理与ELISA
检测应在不同的区域进行，应在不同区域配备独立的加样工具和器材。血
样处理在生物安全柜或超净工作台中进行，ELISA
可在敞开的干净空间内进行。操作区应有专门的固
体和液体废弃物收集容器。
B.1.5 废弃物经高压灭菌后应按有关规定处理。
B.2 个人防护措施
B.2.1 采样及实验过程中应注意个人防护，戴口罩和手套、穿工作服。
B.2.2 在无污染环境中操作，包括：每次使用血样处理与 ELISA
检测操作区域后应及时清理物品，用
75%酒精或10%次氯酸钠溶液消毒；生物安全柜或超净工作台在清洁消毒后，再用紫外线照射30
min。
更多内容 可以 GB-T 32945-2016 牛结核病诊断 体外检测γ干扰素法. 进一步学习